TP-TD 3 : Mise en pratique de l’agglutination et rôle du LT4

I – La technique d’Ouchterlony

Principe de la méthode d’Ouchterlony

Les anticorps et les antigènes possèdent la propriété de diffuser dans la gélose : Il suffit de percer des puits dans une gélose, d’y déposer les substances à tester pour que les substances se rencontrent.

S’il s’avère qu’un sérum contient des anticorps spécifiques d’un des antigènes, il y aura formation, entre les deux puits, d’un précipité en forme d’arc correspondant au complexe immun. Ce test permet de vérifier la spécificité d’un anticorps.

vous manipulez ici sur des produits de substitution mimant les réactions réelles mais permettant une lecture des résultats au bout de 40 minutes. NB : Les résultats fournis correspondent aux résultats réels 

SUJET  : 

Sujet: UN VACCIN CONTRE LES GRIPPES 

Le virus de la grippe saisonnière pénètre par le nez et la bouche, se fixe sur les muqueuses des voies aériennes supérieures grâce à son hémagglutinine. La neuraminidase diminue la viscosité du mucus respiratoire et permet de détacher les virus des cellules, contribuant ainsi à la diffusion de l’infection.

Les virus de la grippe se modifient en permanence au fil du temps. Cette instabilité conduit à l’apparition de nouveaux variants. Les modifications observées sont le reflet de mutations de lhémagglutinine et de la neuraminidase. C’est vers ces protéines que la réponse immunitaire se dirige. Cette année l’épidémie de grippe a durée plus longtemps qu’à l’ordinaire. 4 souches du virus circulaient dans la population:

4 virus : B, A non sous-typé A(H1N1), et A(H3N2)

Document 1 : Evolution de la répartition des virus grippaux et du taux de positivité* depuis la semaine 40 de 2016

Etape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation problème (durée maximale : 10 minutes)

Proposer une démarche d’investigation permettant de déterminer si le vaccin mis en circulation cette année induisait chez les patients vaccinés, une réponse immunitaire spécifique ou pas des 4 souches de grippe.

Etape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables

Mettre en œuvre le protocole d‘immunodiffusion sur gel, afin de déterminer si les anticorps contenus dans le sérum d’un patient vacciné peuvent neutraliser les antigènes présents à la surface des 4 virus.

Appeler l’examinateur pour vérifier  le résultat  et éventuellement obtenir  une aide

(les résultats peuvent ne pas être directement exploitables)

Etape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer

Sous la forme de votre choix, traiter les données obtenues pour les communiquer.

Répondre sur la fiche-réponse candidat, appeler l’examinateur pour vérification de votre production.

Etape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème

Exploiter les résultats pour déterminer si les anticorps contenus dans le sérum d’un patient vacciné peuvent neutraliser les antigènes présents à la surface des 3 virus et trouver une explication à l’ampleur de l’épidémie cette saison.

Répondre sur la fiche-réponse candidat.

Répondre sur la fiche-réponse candidat (forme papier ou numérique).

Protocole d’utilisation du matériel

1. Préparer les boites (boites de pétri) de glose : 

  • Peser dans la coupelle 0,2g d’Agar prélevés à l’aide de la spatule.
  • Verser 14 ml de tampon puis l’Agar dans le bécher et dissoudre soigneusement l’Agar avec la spatule.
  • Chauffer le mélange en remuant jusqu’à ce que le mélange soit limpide et arrêter au tout début de l’ébullition.
  • Retirer le bécher à l’aide de la pince en bois et attendre 1 minute pour manipuler le bécher sans se brûler.
  • Verser 5 ml de gel d’Agar chaud et fluide dans une boîte de Pétri.
  • Egaliser le niveau ; supprimer rapidement les bulles, sans remuer les boîtes avant prise du gel d’Agar, ≈ 5 min.

2. Creuser les puits nécessaires dans la gélose de la boîte de Petri

  • Au fond de la boîte de Petri est coulé votre gel d’agar refroidi.
  • Utiliser le gabarit fourni pour répartir les puits nécessaires.
  • Creuser les puits avec l’emporte-pièce.
  • Utiliser le cure dent pour éliminer les disques de gélose si nécessaire.
  1. a) Choisir et marquer sur la boîte de Petri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l’anticorps étudié avec les différents antigènes proposés.
  2. b) Remplir les puits

Le produit prélevé dans un tube avec un compte goutte propre, doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles, et sans endommager le gel d’agar.

S = Puit central = Sérum de la personne

V1,V2, V3 et V4 : solutions antigéniques

V1= solution antigénique du virus A non sous typé

V2= solution antigénique du virus B

V3 = solution antigénique du virus A1 (H1N1)

V4 = solution antigénique du virus A3 (H3N2)

  1. Observer les résultats fournis sur fond noir et en éclairage rasant

II – Une déficience immunitaire – un exemple de sujet

Un médecin diagnostique chez un homme de 37 ans un sarcome de Kaposi et un zona. Le sarcome de Kaposi est une tumeur de la peau liée à une infection par le virus HHV8 tandis que le zona est une maladie de la peau liée à l’infection par le virus VZV. Les personnes dont le système immunitaire est fonctionnel luttent généralement efficacement contre ces virus et ne développent pas ces maladies.

Question : Proposez une explication à la déficience du système immunitaire à l’origine des deux maladies du patient.

Votre réponse s’appuiera sur l’exploitation du dossier suivant. Aucune étude exhaustive des documents n’est attendue.

Document 1 : analyse de taux d’anticorps

Document 2 : résultat du test de Marbrook chez le patient

On prélève les différents leucocytes et on les met en culture avec un antigène dans un dispositif de Marbrook  (deux chambres séparées par une membrane uniquement perméable aux molécules).

Après 3 jours, le milieu de culture est récupéré et filtré afin de récupérer le liquide proche de la surface (surnageant). Ce surnageant est alors placé au contact d’antigènes.

La présence d’anticorps dans le surnageant se manifeste par une agglutination liée à la formation de complexes immuns.

D’après Nathan SVT TS p 309

Document 3 : dosage des lymphocytes T-CD4 dans les organes lymphoïdes

Source: Jean-Pierre Revillard, Immunologie, p367 et p181

Document 4 : correspondance protéines virales / protéines cibles permettant l’entrée de virus dans les cellules.

La pénétration des virus dans les cellules n’est possible que si certaines protéines présentes à la surface du virus reconnaissent des protéines spécifiques de la membrane plasmique de la cellule hôte. Un virus ne peut donc attaquer que certaines catégories de cellules exprimant des  molécules propres à certains types cellulaires.

Sources : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ et http://www.pnas.org/

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